腦立體定位儀經過搬動或長期不用后，使用前需先加以校驗。重點是檢驗電極移動架各滑尺是否保持直角，可用三角板測定各滑尺所成的角度是否是直角;各銜接部與螺絲有沒有松動;滑尺是否太松;檢查主框兩臂的平行情況;觀察固定頭的裝置兩側對稱程度，小框是否與主框平行。

　　檢查腦立體定位儀*后，可進行下列校驗性操作：

　　1、將兩側耳桿柱旋松，在主框上前后滑動，然后再按照原規定刻度裝好，看兩側耳桿尖是否*對正。

　　2、取下一側耳桿，將一側電極移動架裝好，前后左右上下移動各滑尺，使裝在電極夾上的金屬定位針尖正對耳桿尖的中心，記下各滑尺的刻度讀數，再卸下移動架再裝上，并按上法測定耳桿尖的部位，記下三個滑尺的讀數，反復操作取平均數首先將放置水平的腦立體定位儀上的兩個滑道，按實驗的要求調節好合適的高度后。

　　3、然后再用水平尺調正好兩個滑道的前后、左右水平。這時再把安置在滑道上的手動微推進器按上面的刻度調節垂直。

　　確定腦立體定位零點，小鼠腦定位的系統大致分兩種：

　　1、用耳間線中心定位，首先將兩個耳棒在腦立體定位儀滑道中間部位彼此相接觸(兩個耳棒讀數相同)，旋緊鏍絲。

　　2、取下一側耳棒，另一耳棒不動。調節移動推進器，使校驗電極與耳棒的中心點相觸，即為A點(即耳間線中心點)，并記下刻度值。

　　3、將推進器水平移動到門齒鉤的上方，將門齒鉤平面與校驗電極相觸。這時就定出外耳道中心點與門齒牙板上面上沿之間的水平切面0點，記為H0。這時，動物的前囟和后囟基本處在一個水平面上，相差0-0.1mm。另外，規定耳間線中心點以上為+，向下為-;向嘴側為+，向尾側為-。

　　4、用顱骨標志定位(常用前囟)，即以前囟為嘴尾側0點，由前囟向嘴側為+，向尾側為-，其它與上面定位方法相同。